分子诊断技术的临床应用进展 - 得知互动

　　分子诊断技术主要包括核酸分子杂交技术、核酸扩增技术、基因芯片技术、基因测序技术，已广泛应用于临床各科。比如在肿瘤疾病中应用荧光原位杂交技术（FISH）检测乳腺癌中HER-2基因扩增，应用基因芯片技术检测胃癌进程中基因拷贝数变化，应用高通量测序技术（HTS）检测肺癌中的EGFR基因突变；在遗传病中应用FISH技术针对唐氏综合征进行产前诊断，应用数字PCR技术进行无创产前筛查，应用HTS技术进行Hermansky-Pudlak综合征的诊断；在感染性疾病中应用RT-PCR试剂盒进行新冠肺炎的检测，应用基因芯片技术筛选抗生素抗性基因，孕前筛查应用HTS技术进行耐药基因的筛选等。

　　依据患者的遗传学数据等信息的个体化治疗，可以提高患者的依从性，增强药物疗效，减少治疗成本。分子诊断技术是用分子生物学方法针对人体及各种病原体的遗传物质的表达及结构进行检测，从而达到预测及诊断疾病的目的[1]，为个体化医疗提供数据支持。20世纪60年代，液相分子杂交法的建立意味着分子诊断时代的开启。近年来分子诊断技术发展迅速，可大致分为以下4类技术。

　　核酸分子杂交技术是指不同来源的2条核酸单链，在一定条件下以碱基互补配对的原则特异性形成双链，包括Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、原位杂交、荧光原位杂交（fluorescencein situ hybridization，FISH）等技术。其中FISH是应用有荧光标记的探针与靶片段形成杂交体，通过荧光检测体系获得待测DNA的相关数据，具备特异性强、检测速度快的特点，在产前诊断领域应用广泛。美国医学遗传学学会于1993年发布了应用FISH进行产前诊断的相关说明[2]，FISH技术在我国也应用于临床多年。FISH技术在产前诊断领域作为核型分析技术的补充已成为专家共识[3]。

　　20世纪80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应（PCR），即体外扩增目的核酸片段的技术。核酸扩增技术目前在临床中应用广泛，至今已经发展出多种PCR技术，包括荧光实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、数字PCR（digital PCR，dPCR）等。qPCR技术由于操作过程在封闭体系中进行，降低了污染概率，并且可以通过对荧光信号监测从而进行定量检测，因此临床应用最为广泛，已成为PCR中的主导技术[4]。dPCR也称为单分子PCR，其原理是将单个核酸分子放在独立的反应单元中进行PCR扩增后，检测反应室终点荧光并进行分子计数统计实现定量分析。由于具备高灵敏度、高精确度的特点，不易被PCR反应抑制剂干扰，无需标准品可实现真正意义的绝对定量，而成为研究热点[5]。

　　基因芯片技术的原理是将大量已知序列的核酸探针固定在基片表面，再将其与靶核苷酸杂交，通过对探针的检测获得待测样品的序列信息。依据探针的种类可将基因芯片分成2类，即cDNA微阵列芯片和寡核苷酸微阵列芯片[6]。前者的探针是细胞中特定的mRNA逆转录成的相应的cDNA，而后者的探针为原位合成的寡核苷酸片段。由于基因芯片技术具有自动化程度高、操作简单、通量高等特点，在基因分型、基因表达、单核苷酸多态性检测等方面均有广泛应用。

　　基因测序技术始于1977年由Sanger发明的DNA双脱氧链末端终止测序法，由于它的准确率极高，因而被认为是基因测序的“金标准”，但也同时因成本高、通量低而限制了其在临床方面的应用。进入21世纪后，基因测序技术快速发展，第二代及第三代测序技术相继发明。第二代测序技术也称高通量测序（high-throughput sequenc⁃ing，HTS）技术，相对于一代测序，它可以实现大规模平行测序，基本原理是将基因组分割成短片段，对短片段测序再进行拼接，具备检测用时短、灵敏度高、通量高、经济等诸多优势，极大地推动了分子诊断在临床检测方面的应用，也推进了基因组学的发展。HTS技术是目前临床应用最广的测序技术。第三代测序技术主要是以单分子测序及纳米孔测序为代表，如Oxford Nanopore公司开发的MinION纳米孔测序技术，PacBio公司开发的SMRT测序技术等[7]。它无须核酸扩增，读长明显优于HTS技术，可在基因组水平辅助个体化医疗，是未来发展的主要技术方向。